Nickel pull-down assay protocol (qiagen, 1018244)

Nickel pull-down assay protocol

 

1.준비물

Urea buffer

 

Soluble in water (1L)

8M Urea  ->(MW:60.08, 480.64g)

0.3M NaCl  ->(MW:58.44, 17.53g)

0.05M Na2HPO4 ->(MW:141.96, 7.098g)

0.05M Tris ->(MW:121.14, 6.057g)

0.001M PMSF ->(MW:174.2, 0.1743g)

0.01M Imidazole ->(MW:68.08, 0.680g)

pH 8

Urea wash buffer

 

Soluble in water (urea buffer에서 200ml 가져와서 imidazole을 0.02M로 맞춤, 1M imidazole 용액이있음.)

8M Urea0.3M NaCl0.05M Na2HPO40.05M Tris0.001M PMSF0.02M Imidazole

 

pH 8

2.실험

Nickel Pull-Down Assay with Ni-NTA (Qiagen, 1018244)

 

 

1.Cell Lysis : with Urea lysis buffer

- resuspend cell pellets : by pipetting in 500μl of Urea Lysis Buffer
* volume of lysis buffer = 4X~5X pellet volumes (500ul의 lysis buffer를 넣고 스크랩퍼로 긁어줍니다. 1.5ml tube에 넣습니다. 콧물같이 찐듯합니다.)- sonication : within ICE !! [30sec pulse ON/15sec pulse OFF] X 4 times (total 2min sonication)

(Sonication을 합니다. 그러면 콧물같이 찐듯하던것이 맑고, 부드럽게 물처럼 움직이면 됩니다.)

- remove the cell debris : 14000RPM, 4℃, 10min centrifugation(상층액을 다른 tube로 옮깁니다.)- Keep the supernatant in new microtubes이후에 상층액중 일부로 Lysate sample을 먼저 만들어야합니다. 나머지는 IP 샘플을 만들겁니다.10μl of the supernatant + 2X SDS sample buffer 10μl  for 5min, 95℃ Boiling

 

1-1. (1번의 centrifuge할때 준비사항)

-bead washing : 4도에 있는 bead를 well당 50ul 정도 사용한다. (4개면 200ul)

-먼저 bead를 (최대속도, 1분) spindown한다. 그리고 lysis buffer를 적당히(500ul) 넣고 spin down한다. 그리고 다시 lysis buffer로 다시 washing한다.

-마지막에 상층액버리고 bead만 남긴다. 2x lysis buffer dilution 한다.

-sample (lysate 샘플 외의 supernantant를 사용)에 50ul bead를 넣는다.(pippet tip 앞부분을 약간 자른다).

-- RT, 9RPM, 4hr shaking (회전시키면서) incubation.

 

2. Wash

- Wash 5X each beads with Urea Wash Buffer 1ml

- after last wash : Remove the supernatant perfectly with needle (비드만 남김)

* centrifugation condition for bead pellet : 12000RPM, 30sec (10000rpm, 1min bead의 결합이 떨어질까봐 좀 약하게함.)

4. Elution

- add 30μl ~ 40μl of 2X SDS sample buffer to each sample (6X SDS 20ul 넣고, tapping한다. 그리고 spindown한  뒤  끓인다.)

- 95℃, 5min boiling (shaking하면서)

- centrifuge : 12000RPM, 60sec (비드는 버리고 상층액만 사용)

 

5. Western Blots : loading the supernatant (volume 상관 없이 input과 output을 걸어준다.)

7% sds gel에서 로딩.(ub가 끌리는 것을 봐야하기때문이다.)

 

Buffer Preparation of nickel Pulldown assay : Urea buffer based