Calcium chloride를 이용한 Transfection to HEK 293 cells

 

Calcium chloraid를 이용한 Transfection to 293T cells

*293T cell이 overgrowth하여 배지가 산성으로 되지 않도록 해야 함.

 

SEEDING

1) 100mm dish 기준으로 2x10^6 로 seeding (transfection 하고 이틀 후 harvest 예정,  cell 수는 알아서 정해야 함)

(35mm dish, 3x10^5), DMEM은 10ml로 키움.

*Incubationb until 60% confluency

 

TRANSFECTION

1) Transfection 하기 한 시간전에 5ml DMEM을 추가하여 total 15ml(35mm dish, 총 4ml되도록) 로 만들어 놓음.

 

2) 미리 2X HBS를 얼음에 넣어둠.

 

3) 2ml e-tube 두 개를 준비한다.

 

e-tube 1	e-tube 2
2X HBS : 900ul  (35mm, 150ul)	ddH2O :  total 788.4ul되도록 마지막에 맞춤 (35mm, 131.4ul)
	DNA : 12ul (원하는 양)
	CaCl2 : 111.6 (35mm, 18.6ul)

 

4) 2번 tube에 CaCl2를 넣고 섞은 후, 즉시 2X HBS에 넣어 준다.

*주의: 1번 2X HBS tube를 손가락으로 튕기면서 , 2번 tube의 mixture를 한 방울씩 똑똑 떨어트리면서 천천히 넣어준다. (votexing 금지)

 

5) 20~40min RT에서 incubation

 

6) 섞은 mixture는 100mm dish에 한 방울씩 떨구면서 골고루 뿌려준다. 배지는 orange색으로 변함. (십자로 살살 섞어준다.)

 

7) 몇 시간 후 침전 생성, size는 무관하고, 마치 contamination된 것처럼 검정색 점이 떠다닌다.

 

8) 4~6시간 후 새 배지로 갈아준다. (침전이 남을 수도 있다.)

 

9) DNA를 넣고 48시간 후, harvest 한다.

 

REAGENT

 

 

 

1) 2X HBS

 

Reagent	Final	Grams dry
HEPES,ph7.05	50mM	5.0g
KCl	10mM	0.37g
dextrose	12mM	1g
NaCl	280mM	8.0g
Na2HPO4	1.5mM	0.1065g

 

다른 방법으로는 각 reagent를 수용액으로 만들어서 섞어 쓰는 방법이 있습니다.

 

HEPES (1M) : 2.5ml

KCl (1M): 500ul

dextrose (1M): 600ul

NaCl (5M): 2.8ml

Na2HPO4 (1M): 75ul

total: 50ml

 

2)CaCl2

CaCl2

2M

29.4g/100ml

 

<공감 버튼 꾹 부탁 드립니다. 감사합니다.>