세포에 형광칠 해볼까요! -IMMUNOCYTOCHEMISTRY (ICC)

 

IMMUNOCYTOCHEMISTRY (ICC)

 

이번에 마우스 실험을 하게되면서 조직을 염색해야해서, 가지고 있는 Antibody가 제대로 작동하는지 아닌지 확인학자 immunocytochemistry를 하게 되었습니다.

저는 초보니 실험실 친구들의 도움을 받아서 했습니다. 

마지막에 세포에서 핵도 염색되고 target protein을 빨강색으로 보니 논문 준비 중인데 이런 그림도 하나 넣어보고 싶은 생각이 들었습니다.

하지만 괜히 또 시작했다가 언제 끝날지 모르는 궁렁텅이로 빠질까봐 한번 해보겠다는 말은 못하겠습니다.

어째든 처음으로 immunocytochemistry (ICC)를 처음 하시는 분들도 따라할 수 있도록 쉽게 설명해보도록 해보겠습니다.

한글로 제가 한 방법을 적었고 아래는 원래 abcam에서 제공하는 방법을 적어놨습니다.

참고하시기 바랍니다.

 

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General procedure 

*이 과정은 물어보니 특별히 코팅을 할 필요없습니다.

 

1. Cover glass를 벤치안에서 알콜램프로 화염멸균을 하고 바로 12 well에 넣어줍니다. 

 

2. Seeding을 12well에 해주는데 보통보다 1/3정도 낮은confluency로 깔아줍니다. 세포하나하나 잘보기 위해서 입니다.

 

3.저는 약물처리 없이 세포에 Ab만 처리할 예정이라 seeding해주고 그다음날 바로 fixation을 진행했습니다.

well 안에 cover glass가 깔려있고 그 위에 세포를 키웁니다.

 

 

1. Coat coverslips with polyethylineimine or poly-L-lysine for 1 hr at room temperature. 

2. Rinse coverslips well with sterile H2O (three times 5 min each). 

3. Allow coverslips to dry completely and sterilize them under UV light for at least 4 hr. 

4. Grow cells on glass coverslips or prepare cytospin or smear preparation. 5. Rinse briefly in phosphate-buffered saline (PBS). 

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Fixation

* 먼저 cover glass위에 세포가 떨어지지 않도록 조심하면서 미리 차갑게 만든 ice-cold PBS로 두번 washing 해줍니다.

 

1. 1ml의 pre-chilled methanol을 RT에서 10분 동안 incubation 해줍니다. (아니면 3-4% paraformaldehyde 사용) 

 

2. ice-cold PBS로 매우 매우 조심히 2번 washing 해줍니다.

 

1. Fix the samples either in ice-cold methanol, acetone (1-10 min) or in 3-4% paraformaldehyde in PBS pH 7.4 for 15 min at room temperature. 

2. Wash the samples twice with ice cold PBS. 

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Permeabilization

*혹시 보시려는 protein이 memebran protein이라면 permeabilization을 안하셔도 됩니다. 그리고 fixation에 acetone을 사용했다면 이미 permeabilization이 된 것입니다.

 

If the target protein is localized intracellularly, it is very important to permeabilize the cells. 

Acetone fixed samples do not require permeabilization.

 

*준비물 - PBS with triton X-100 (125ul TritonX-100 in 50ml PBS)

 

1. 0.25% tritonX가 들어간 PBS를 700ul넣고 (아! 저는 12well 기준으로 이야기 하고 있습니다.)  RT, shaker에서 10분간 인큐베이션 시켜줍니다. 천천히 shaker를 돌려주세요.

 

2. PBS로 세번 5분마다 washing 합니다. RT, shaker에서 해줍니다.

 

1. Incubate the samples for 10 min with PBS containing 0.25% Triton X-100 (or 100 μM Digitonin or 0.5% Saponin). Triton X-100 is the most popular detergent for improving the penetration of the antibody. However, it is not appropriate for membrane-associated antigens since it destroys membranes.

2. Wash cells in PBS three times for 5 min.

 

Blocking and Immunostaining 

* PBST 대신 그냥 PBS를 사용해줍니다.

 

* 1% BSA가 들어간 PBS를 만들어줍니다. (0.1g BSA in 10ml PBS)

 

1.1%BSA가 들어간 PBS를 700ul 각 well에 넣어서 Western blot처럼 30분 동안 blocking을 해줍니다.

 

2. 거기에 자신이 원하는 1st Ab를 넣어줍니다. 한 시간동안 RT에서 incubation하거나 4도에서 O/N 으로 incubation합니다. 물론 shaker에서 말이죠.

 

저는 3가지 Ab를 Test했습니다.

 

* 용량은 각 Ab 시트지에 있는 ICC 용량을 확인해줍니다.

CST꺼는 1:100정도였던 것 같고, abcam은 1:500 인가였던 것 같습니다. 하여튼 Western 보다 굉장히 많이 들어갑니다.

그래서 작은 well을 사용한 것이지요. 저는 랩을 사랑하니깐요~!

 

3. PBS로 3번씩, 5분마다 washing해줍니다.

 

4. 2차 Ab를 붙이는 과정입니다. 1%BSA in PBS에 형광이 달린 2nd Ab를 1:300으로 넣어줍니다. 제가 쓴것은 alexa 588 (red)를 넣어줍니다.

그리고 한 시간동안 RT, shaker에서 incubation해줍니다. 호일로 둘둘 감싸줍니다..

 

*이제부터 형광이 달린 Ab를 사용하므로 호일로 12 well을 감싸줍니다. 살짝 살짝 실험할때만 열어줍니다

 

5. 호일을 살짝 열어서 5분마다 PBS로 3번 washing해줍니다. PBS로 700ul 채워줍니다.

필요할때만 열어서 실험을 합니다.

 

1. Incubate cells with 1% BSA in PBST for 30 min to block unspecific binding of the antibodies (alternative blocking solutions are 1% gelatin or 10% serum from the species from which the secondary antibody was raised in. Please see antibody datasheet for recommended blocking). 

2. Incubate cells in the diluted antibody in 1% BSA in PBST in a humidified chamber for 1 hr at room temperature or overnight at 4°C. 

3. Decant the solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash. 

4. Incubate cells with the secondary antibody in 1% BSA for 1 hr at room temperature in the dark. 

5. Decant the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in the dark. 

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Counter staining 

1. 핵을 염색하기 위해서 10mg/mL DAPI를 1:5000으로 PBS에 넣어줍니다. 10분간 shaker에서 incubation. (이때도 계속 호일에 쌓여있어야합니다.)

 

2. PBS로 washing해줍니다. 

10mg/ml의 DAPI 세포핵을 염색하는데 사용합니다. 색은 파랑 형광.

 

1. Incubate cells on 0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA stain) for 1 min. 

2. Rinse with PBS. 

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Mounting 

1. 유리판을 준비해줍니다. 여기 위에 mounting medium을 한방울 떨어트립니다.

유리 판에는 2개정도 cover glass를 올릴 수 있습니다.

 

2. 그리고 세포가 자란 면이 mounting medium이 닿도록 뒤집어서 덮습니다. 이때 기포 들어가지 않도록 조심하시고 막 비비면 안됩니다.

기포 빼기위해 살짝 핀셋으로 눌러주는 정도까지는 괜찮습니다. 그리고 호일에 빛이 안들어오게끔 쌓아서 하루정도 말립니다.

cover glass가 아주 지저분하게 붙어 있는 것을 볼 수 있습니다. (저는 초보니깐요!)-나중에 닦아주면 됩니다.

 

3. 그리고 다 마른 후 투명 메니큐어를 이용해서 cover glass 테두리를 따라 둘러 칠해줍니다. 이것은 유리판을 뒤집어서 형광현미경을 사용할때 떨어지지 않도록 고정하는 용도 입니다.

 

4. 메니큐어가 다 말랐다면 알콜을 휴지에 묻혀서 cover glass 위에 올라와있는 mounting medium을 살살 닦아주면 깨끗이 닦여집니다.

 

이제 완성~! 이것은 형광 현미경으로 찍기 전까지는 dark한 곳에서 보관해주세요.

 

1. Mount coverslip with a drop of mounting medium. 

2. Seal coverslip with nail polish to prevent drying and movement under microscope. 

3. Store in dark at -20°C or +4°C.

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형광 현미경

저도 현광 현미경은 처음이라서 구체적으로 적을 수 없지만 다루다보면 충분히 할 만했습니다. 물론 누가 가르쳐주면 더 좋겠지요?!

 

시키는 데로 켜주고 꺼줍니다. 초보에게는 시키는데로 하는게 제일 좋습니다.

 

현미경 옆으로 다양한 기기들이 놓여 있습니다. lamb도 있고 camera controller도 있고 motorizing controller도 있고, 여러가지들이 있습니다. 그건 그냥 켜기만 하고 건들지 맙시다.

4개의 부속들. 순서대로 켭니다.

 

 

유리판을 뒤집어서 고정을 해줍니다. cover glass가 아래 방향을 향하도록해줍니다.

 

4X~100X는 배율입니다. DAPI는 말그대로 DAPI를 찍을때, FITC는 녹색 형광을 찍을때 사용합니다. TRITC는 붉은색 형광을 찍을 때 사용합니다.

 

형광 현미경을 이리저리 돌리면서 세포를 찾아주고 DAPI를 누르면 필터가 바뀌면서 염색된 핵을 볼 수 있습니다. 그리고 핵으로 초점을 맞춥니다. 그리고 저같은 경우는 붉은색 형광이라서 TRITC를 클릭하면 붉은색 형광이 보입니다. Contrast를 조절해주면 이쁘게 나옵니다.

다음은 제 결과 입니다. 생각보다 안이쁘지만 저는 초보니깐 괜찮습니다. 그리고 Ab test이니깐 괜찮습니다.

DAPI는 핵을 나타내고 다른 붉은 색은 각각의 Ab가 잡는 protein의 위치를 보여줍니다. 두개 그림을 합치니 핵과 protein의 위치를 같이 볼 수 있습니다.

언제 이렇게 찍을 수 있을까요?!ㅜㅜ

 

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ICC 초보라서 protocol 정리할겸 혹시 처음 Immunocytochemistry를 해보시는 분이 있다면 도움이 되고자 한번 적어봤습니다. 물론 사수분들이 잘 가르쳐주시겠지만 혹시 물어보기 애매한, 물으면 혼날것 같은 부분있다면 언제든지 질문해주세요. 제가 다른 분께 물어서 답해드릴게요. 감사합니다.

 

<공감과 광고 클릭은 늘 감사합니다>